人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于检测人血清，血浆中抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)水平。
实验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)。用纯化的人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)的存在与否。
试剂盒组成：
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试剂盒组成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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说明书
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1个
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1个
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酶标包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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阴性对照
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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阳性对照
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶标试剂
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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样品稀释液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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显色剂A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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显色剂B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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终止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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浓缩洗涤液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1、标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为36ng/L，24ng/L ，12ng/L，6ng/L， 3ng/L）。
2、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4、配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7、温育：操作同3。
8、洗涤：操作同5。
9、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10
临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)阴性
阳性判定：样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为人抗乙酰胆碱受体抗体(AChR)阳性
注意事项
1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物请避光保存。
6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm
7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月